Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
М - максимальная человеческая доза = 15 мг на килограмм массы тела в час. с = 50 мг/мл.
К = 5 МЕ эндотоксина на килограмм в час.
Л = 0,4 МЕ эндотоксина на миллилитр.
, 5 х 50 1 „,
МДР =------х — = 41,67
15 0,4
Для рутинных испытаний этого продукта может быть целесообразно 1 мл испытуемого раствора разбавить до 20 мл (величина МДР/2, округленная до ближайшего меньшего целого числа). Однако, если испытание дает положительный результат, следует 1 мл разбавить до 41,67 мл и повторить испытание. Разведение до 41,67 необходимо также в тех случаях, когда испытание проводится для разрешения спорной ситуации.
3. СТАНДАРТНЫЙ МАТЕРИАЛ
Стандарт эндотоксина BRP используется в качестве препарата сравнения. Его количественное определение проводят в сравнении с Международным стандартом эндотоксина ВОЗ, и его активность выражается в МЕ эндотоксина в ампуле. Международная единица эндотоксина определяется как специфическая активность определенной массы Международного стандарта.
Для рутинных целей может быть использован другой препарат эндотоксина, при условии проведения его количественного определения в сравнении с Международным стандартом эндотоксина или BRP, и его активность выражена в МЕ эндотоксина.
Примечание: Одна международная единица (МЕ) эндотоксина эквивалентна одной единице эндотоксина (ЕЭ).
4. ВОДА ДЛЯ ИБЭ
Определение отсутствия эндотоксина в продукте путем проведения испытания на пирогенность на кроликах было исключено по практическим и теоретическим причинам:
4.1. Испытание на кроликах не обладает достаточной чувствительностью для определения эндотоксина в воде для ИБЭ, предназначенной для проведения испытаний продуктов с очень низкой предельной концентрацией эндотоксинов;
4.2. Относительно низкая точность температурной реакции у кроликов привела бы к необходимости проведения большого количества повторных испытаний;
4.3. Термины «пирогены» и «эндотоксины» относятся к группам веществ, которые не достаточно полно совпадают друг с другом.
В описании испытания на бактериальные эндотоксины указывается, что для приготовления воды для ИБЭ, кроме трехкратной дистилляции, могут быть использованы и другие методы. К хорошим результатам приводило использование метода обратного осмоса; некоторые аналитики могут предпочесть перегонять воду более трех раз. Какой бы метод ни использовался, полученный продукт не должен содержать поддающихся определению эндотоксинов.
5. рН СМЕСИ
Оптимальное гелеобразование смеси при проведении испытания на бактериальные эндотоксины достигается при значениях рН от 6,0 до 8,0. Однако, добавление лизата к образцу может привести к снижению рН.
6. ВАЛИДАЦИЯ ЛИЗАТА
При приготовлении растворов лизата важно следовать инструкциям производителя.
Факторы положительных конечных разведений в методах гелевого сгустка А и В переводят в логарифмы. Причина этого заключается в том, что если построить график частотного распределения этих логарифмических значений, то он обычно намного ближе к кривой нормального распределения, чем частотное распределение самих факторов разведения; фактически, они настолько близки, что допускается использование нормального частотного распределения в качестве математической модели и вычисление границ доверительного интервала с помощью t-критерия Стьюдента.
7. ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ИСПЫТАНИЕ НА МЕШАЮЩИЕ ФАКТОРЫ
Некоторые продукты не могут быть подвергнуты испытанию на наличие эндотоксинов непосредственно, так как они не смешиваются с реактивами, не могут быть доведены до рН 6,0-8,0 или являются ингибиторами или активаторами геле-образования. Поэтому требуется проведение предварительного испытания для проверки наличия мешающих факторов; в случае их обнаружения должно быть продемонстрировано что, процедура их удаления была эффективной.
Цель предварительного испытания состоит в проверке нулевой гипотезы о том, что чувствительность лизата в присутствии продукта существенно не отличается от чувствительности лизата в его отсутствии. В методах А и В используется простой критерий: нулевая гипотеза принимается, если чувствительность лизата в присутствии продукта составляет не менее 50% и не более 200% чувствительности самого лизата.
В соответствии с классическим подходом, следует вычислить среднее значение логарифма коэффициента разведения для чувствительности в присутствии и отсутствии продукта и оценить разницу между двумя средними значениями с помощью t-критерия Стьюдента.
Испытание на мешающие факторы в методах гелевого сгустка А и В требует использования образца продукта, в котором отсутствуют эндотоксины в поддаю-
щейся определению концентрации. Это представляет теоретическую проблему при испытании абсолютно новых продуктов. Поэтому для количественных методов С, D, Е и F был разработан другой подход.
8. ИСКЛЮЧЕНИЕ МЕШАЮЩИХ ФАКТОРОВ
Методика удаления мешающих факторов не должна приводить к уменьшению или увеличению количества эндотоксинов в испытуемом продукте (например, вследствие адсорбции). Корректный способ проверки этого состоит в применении методики к обогащенному образцу продукта, т.е. к образцу, к которому было добавлено известное количество эндотоксина, с дальнейшим измерением его возврата.
